关于生信分析或基础研究，我们遵循“表达有差异，差异影响表型”的原则。符合以上两条，文章就成型了。分子机制探究，是升华。然而，纯生信已经很难，甚至无法发表论文了。因此，我们必须掌握差异表达相关的实验操作。

在研究基因功能时，无论是过表达，还是基因敲除，我们都需要通过PCR获得产物，构建载体；在转录水平验证时，我们可以通过RT-qPCR检测基因的表达及其变化。今天，我们分享下RT-qPCR的理论和实操。主要检测方法有两种，我们以更常用的SYBR为例展开。

需要区分，PCR是以双链DNA为模板，以dNTP为底物进行的定性扩增，产物为dsDNA。qPCR是实时定量反转录PCR (Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR)，以DNA为模板，以dNTP为底物，对扩增出的DNA进行定量分析。数字PCR（dPCR）也是以DNA为模板，但不依赖于CT值和标准曲线，实现PCR的绝对定量。RT-PCR是以mRNA逆转录成的cDNA为模板，进行DNA的扩增，结果只能定性或半定量。RT-qPCR，是qPCR与RT-PCR的组合，以总RNA或mRNA逆转录成的cDNA为模板，以dNTP为底物，进行qPCR的定量分析。qRT-PCR的称呼有不少，但是总体说成为实时定量逆转录聚合酶链式反应（Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR）可能更准确。

cDNA是由mRNA逆转录而来的互补DNA，可用于基因表达载体构建；也可作为RT-qPCR的模板。cDNA是单链还是双链得根据实际情况。RT-PCR体系中只有逆转录酶，我们得到的是单链cDNA。在构建表达载体时，PCR反应体系中含有DNA聚合酶，因此是dsDNA。一般情况下，cDNA指体外逆转录后与RNA互补的DNA链，只有外显子序列。

SYBR Green是一种与双链DNA小沟结合的染料。在PCR反应体系中，SYBR荧光染料可以特异性地掺入DNA双链。在与双链DNA结合后，发射荧光信号，而不掺入双链中的Sybr染料分子不发射荧光信号，从而保证与PCR产物的增加完全同步。利用荧光染料可以指示双链DNA熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以区分非特异扩增，进一步地还可以实现单色多重测定。

但是，由于SYBR Green可与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的准确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异性产物的影响。

基线（Baseline）可以看作仪器的检测极限；ΔRn（时间点荧光增量）指每个时间点荧光信号的增量，ΔRn值与循环数关系（S型）；阈值（Threshold）是根据基线而变化的荧光水平。高于阈值的信号被认为是实信号，可定义样本阈值周期 (Cycle threshold, Ct)。Ct是实时PCR的基本原理，是产生准确和可重复数据的重要组成部分。

RT-qPCR一般设置三个复孔，内参β-actin或GAPDH均可，特殊条件下根据实际情况定。RT-qPCR加样体系参考试剂说明书即可，我们准备好引物（上游引物 & 下游引物）以及cDNA模板和ddH2O即可。SYBR Mix RT-qPCR加样体系如下。

RT-qPCR的扩增程序包含变性-退火-延伸三步。但是RT-qPCR仪器会在在退火/延伸时，采集荧光数据，并绘制溶解曲线（仪器默认设置）。根据说明书设置即可。数据分析时，计算公式是2^-△△Ct。△Ct=Gene Ct – β-actin Ct；△△Ct=△Ct - 对照△Ct。

参考链接：https://mp.weixin.qq.com/s/8L7DJ2Mc3HEtjoJNL3X3IQ